? ?服務熱線:
4001169598
細胞代謝組學分析
代謝組學主要是對特定條件下或某一時刻細胞內代謝物進行的分析, 因細胞內酶系活躍、代謝轉換迅速, 取樣和樣品制備方法顯著影響分析結果的準確性、重復性。因此, 做好樣品的前處理是取得可靠分析結果的先決條件。根據研究對象、目的和分析技術的不同, 對樣品的前處理要求也不一致, 不存在一種普適性的方法, 樣品處理方法大致分為兩步: 細胞淬滅和代謝物提取。
淬滅也稱為“滅活”, 目的是讓細胞內的酶失活, 保證代謝物的輪廓“凍結”。對于胞內代謝物, 由于采樣或脫離培養環境后細胞內代謝狀態的變化, 造成代謝物種類及含量也隨之發生變化, 為了正確反映培養環境中細胞代謝物的真實信息, 需要立即淬滅細胞, 終止胞內反應。理想的淬滅技術應在保持細胞完整性的基礎上確保酶迅速失活。淬滅方法包括液氮冷凍法、酸堿滅活法、快速過濾法、低溫離心法、細胞刮法、冷甲醇法等。采用低溫離心法及細胞刮法淬滅多種貼壁哺乳細胞, 結果發現低溫離心可引起細胞內大量代謝物的泄漏, 不適于代謝組學研究, 而細胞刮法較為理想。
研究發現, 淬滅過程會導致泄漏即細胞內代謝物的丟失, 且泄漏的程度與淬滅時間、溫度及加入的淬滅試劑量等有關; 隨著淬滅劑的加入、淬滅時間減少、離心速度加快, 泄漏程度會減輕。既然代謝物泄漏在所難免, 在進行樣品前處理時應盡量將泄漏的影響降到最低, 并注意平行操作, 快速淬滅后, 迅速低溫離心收集樣品。另外, 由于受細胞種類或分析技術的影響, 不同淬滅方法效果可能存在差異, 在實際應用中應做全面考察, 選擇最佳淬滅方法。
代謝物提取一旦代謝反應通過滅活被停止, 代謝產物就需要從細胞中提取出來。根據細胞代謝組學研究層次不同, 提取方法及要求也不同。如在靶標分析中, 需要采用特定的方法有選擇性地提取出相應的組分; 而在輪廓分析中, 則需盡可能提取出多種代謝物。目前許多研究者以細胞能量代謝中間產物的量為指標, 對多種提取方法進行了系統考察, 但因各細胞株種類、培養條件、培養基組成及細胞生理條件等不同, 造成代謝物水平差異較大, 至今仍沒有統一的標準方法, 實際中應根據化合物及實驗目的的不同選擇相應的提取方法。一般提取時應遵循以下原則: ①以適當的回收率從細胞中提取最大量的代謝產物; ②代謝物不應該遭遇任何理化修飾, 將降解控制在最小范圍內; ③防止代謝物泄漏; ④具有非破壞性。
從不同分析角度觀測
1、代謝靶向分析
代謝靶向分析是針對某個或某幾個特定組分的定量分析。因其焦點為特定化合物的分析,通常忽略其他大量的代謝組信息, 故需要采用具有選擇性的樣品制備技術除去干擾物, 或選擇一定的數據預處理技術去除干擾物色譜峰, 優化數據質量, 提高方法靈敏度和代謝物濃度測定的準確性。但當目標物處于重疊色譜峰中時, 需借助專門的化學計量學技術進行解析, 如平行因子分析法、多元曲線分辨?交互最小二乘法(MCR-ALS) 等。目前, 該研究主要集中于與癌細胞能量代謝相關的化合物研究, 如核苷類、氨基酸類、脂類、糖類等。
2、代謝輪廓分析
代謝輪廓分析是對預設的一些代謝產物的定量分析, 如某一結構、化學性質相似的化合物、預先選擇的某些代謝途徑的所有中間產物、多條代謝途徑中的標志性組分等, 是對大范圍內的代謝物進行檢測, 目的是獲得一套完整的、綜合的代謝組輪廓, 以便更直觀地理解參與代謝的化合物之間以及所有酶之間的相互作用, 是對細胞代謝的抽象表達。目前, 采用基于NMR法的代謝輪廓分析已尋找出多種與能量代謝相關的標記物, 主要涉及到糖酵解、三羧酸循環、膽堿和脂肪酸代謝等, 在癌癥診斷和治療方面扮演著重要角色。此外, 國內外許多研究者對各種腫瘤細胞的代謝輪廓與細胞形態學變化之間的相關性進行了研究, 但細胞內的代謝組不是靜態的, 不同個體對外界擾動所作出的響應也存在較大的差異, 使得代謝物的準確測定及其與疾病的相關性研究仍面臨著巨大挑戰。
3、代謝組學分析
代謝組學分析是采用高通量的分析技術對限定條件下的特定生物樣品中代謝組分的定性和定量, 即整體性地分析生物體對內外因素做出動態應答的所有代謝物小分子。生物體在受到外源性干擾后, 其所處的內環境也相應的發生改變, 原本正常的代謝狀態也隨之發生變化。在細胞研究的層面上, 其研究的是細胞受到外界擾動后胞內所有代謝物的綜合表現——全局觀點, 通常采用現代分析方法、計算機技術及統計方法, 以高通量實驗和大規模的計算為特點, 尋找生物體應激前后代謝差異, 進而確定與疾病相關的生物標記物。
任何預測藥物吸收、分布、代謝、排泄以及毒性評價成功的技術都需要關聯內源性物質代謝變化來考慮藥物的代謝情況, 因此通過代謝組學技術不僅可研究藥物本身的代謝, 還可研究藥物及其他外界刺激引起的內源性代謝組的變化, 更能直接地反映體內生化過程, 闡明藥物靶點或作用機制。
癌細胞具有旺盛的代謝狀態, 而癌癥的發生、發展亦離不開細胞周圍的微環境。腫瘤生長所依賴的微環境主要包括葡萄糖、氧分及其他營養性生長因子, 并呈現出明顯的酸性, 而乳酸鹽等一些小分子物質是構成這種酸性環境的主要成分, 因此乳酸鹽含量增加也預示著癌癥的發生。目前, 國內外許多研究者考察了多種外界擾動(如低氧、營養物質、藥物等) 對細胞代謝的動態變化、細胞生長狀態及代謝關鍵酶活性等的影響。
4、代謝足跡分析
研究表明, 生物體在生長過程中會分泌大量代謝物, 特別在不平衡生長條件下, 能分泌許多具有生理活性的初級和次級代謝物以及信號分子, 這種分泌過程能清晰地反映細胞的代謝活動以及相關基因的轉錄和翻譯水平, 即細胞外代謝組學。該分析技術已成功應用于代謝組學研究中, 是由英國科學家Kell等在2003年首先設計出的一種用于代謝組學細胞功能分析的新技術, 其采用直接注射質譜技術, 以細胞培養液為分析對象, 監控細胞從生長培養基中消耗營養物以及分泌代謝物質培養基的全部過程。Kell將其定義為細胞外代謝組學, Nielsen和Oliver 等引入Endo-Metabolome和Exo-Metabolome術語以區分細胞內、外代謝物。該分析技術可與細胞內代謝組研究相互補充, 為進一步完善代謝組學的研究范圍打下堅實基礎?！?/p>
代謝足跡分析與前述細胞內代謝物的分析不同, 具有以下特點: ①樣品制備過程簡便, 無需淬滅及提取步驟; 因細胞內代謝物是動態的, 且大多數代謝物的轉換速度極快, 從幾秒鐘至幾分鐘, 故需快速淬滅細胞以凍結新陳代謝, 再采用一定的方法提取代謝物, 上述實驗均增加了操作上的困難, 很可能造成對代謝通量的誤解; ②胞內某些生化反應與胞外基質相關, 如復雜基質的降解反應、細胞信號傳導調控等, 只能通過細胞外降解產物的測定來評價; ③便于考察細胞對外界物質的利用情況, 優化細胞培養技術。
技術路線及方法：
檢測類型樣本包括：血清/血漿、肝臟、腎臟、腫瘤、腸道組織、尿液、腸道內容物等
樣本體積：液體樣本200ul，組織樣本200mg。
